小鼠肠道干细胞流式分选
FACS Isolation of Mouse Intestinal Stem Cell   

材料与试剂

1. 40 μm细胞筛 (Corning, catalog number: 431750)
2. 70 μm细胞筛 (Corning, catalog number: 431751)
3. 巴氏吸管 (3 ml，上海晶安)
4. 10 cm dish (Griner, catalog number: 664160)
5. FACS管 (BD Falcon)
6. 15 ml，50 ml离心管 (Gene Brick)
7. Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 (Lgr5-GFP) mice (Jackson Laboratory, USA)
8. FBS (NTC)
   
9. Rat anti-CD45 (1:200, BD Biosciences, catalog number: 557659)
10. Rat anti-CD31 (1:500, eBioscience, catalog number: 12-0311-82)
11. Rat anti-TER119 (1:500, eBioscience, catalog number: 12-5921-82)
12. Rat anti- EpCAM (1:300, eBioscience, catalog number: 17-5791-82)
    
13. Advanced DMEM/F12 (Life Technologies, catalog number: 12634028)
14. HEPES (Sigma-Aldrich)
15. GlutaMax (Gibco, catalog number: 35050061)
16. Penicillin-Streptomycin (Gibco, catalog number: 15140163)
17. N2 supplement (Gibco, catalog number: A1370701)
18. B27 supplement (Gibco, catalog number: 17504044)
19. N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-Aldrich, catalog number: A9165)
20. D-PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ free，预冷)
21. EDTA (Sigma-Aldrich)
22. Y-27632 (Sigma-Aldrich, catalog number: Y0503)
23. TrypLE Express (Gibco, catalog number: 12604021)
24. 7-AAD Viability staining solution (Life Technologies, catalog number: 00-6993-50)
25. Basal medium (见溶液配方)
26. Sorting medium (见溶液配方)

仪器设备

1. 眼用剪 (10 cm直剪, 上海三友, catalog number: 042000)
2. 眼科镊 (10 cm弯,上海三友, catalog number: 044571)
3. 电动移液器 (Eppendorf Easypet 3)
4. 37 °C水浴锅 (上海精宏, catalog number: DK-420)
5. 4 °C 离心机 (Eppendorf, model: 5804R)
6. 流式分选仪器 (BD Aria III)
   

实验步骤

一、分离小鼠小肠隐窝

1. 将6~8周的Lgr5-GFP小鼠执行安乐死后，取小鼠小肠，在离体前尽可能地去除肠系膜，用PBS冲洗肠道内的粪便，并沿肠道纵向剖开。
2. 用ice-cold PBS将肠道组织清洗两遍，并剪成2~4 mm的小片段，转移至15 ml离心管。
3. 向15 ml离心管中加入12 ml 30 mM EDTA-PBS，水平置于冰上，在4 °C冷库摇床孵育20 min。
4. 将组织转移到一个新的15 ml离心管中，加入10 ml PBS，大力垂直手摇4 min。
5. 待组织沉入管底后，将上清含有隐窝细胞的悬液过70 μm细胞筛，置50 ml离心管中 (若需要得到大量的隐窝细胞，可重复步骤3~5两到三次)。
6. 将滤过的隐窝细胞悬液150 × g，4 °C离心10 min。
7. 将上清小心去除，并用预冷的PBS或者advanced DMEM/F12将隐窝细胞清洗两次，离心步骤同6。
   
   

二、分离肠道干细胞

1. 将7中分离的隐窝细胞转移至新的15 ml离心管，2 ml TrypLE Express消化液重悬，37 °C水浴锅孵育5~10 min。
2. 用10 ml移液管吹打重悬数次，取10 μl细胞悬液于显微镜下进行镜检，> 50%细胞消化成单细胞即可。
3. 加入终浓度为10%的FBS，并将细胞悬液滤过40 μm细胞筛。
4. 将滤过的隐窝细胞悬液500 × g，4 °C离心5 min。
5. 用Basal medium清洗细胞2次，离心步骤同4。
6. 将细胞进行CD45/Ter119/CD31/EpCAM染色 (不同抗体溶度参照抗体说明书)，4 °C孵育30 min (目的是为了去除免疫细胞等非上皮细胞)。
7. 500 × g，4 °C离心5 min，并用PBS洗两次。
8. 将细胞重悬于Sorting medium中 (约5 × 10⁶个/ml)，上机前5 min进行7AAD染色，以去除死细胞。
9. 将制备好的单细胞悬液转移至FACS管中，通过Aria III进行流式分选，gating strategy: 7-AAD- CD45-Ter119- CD31- Epcam⁺, GFP^high的细胞群为肠道干细胞，GFP^low的细胞群为祖细胞。

结果与分析

Lgr5-GFP小鼠的绿色荧光呈嵌合表达，约20%的隐窝细胞有绿色荧光。富集分离得到的完整隐窝如图1A，分选得到的GFP^high和GFP^low细胞群如图1B。一只小鼠平均可分选得到1 × 10⁵到1 × 10⁶个肠道干细胞和祖细胞。

图1. 小鼠肠道隐窝和肠道干细胞的分离. A. 分离得到的完整的肠道隐窝。B. 流式分选得到Lgr5-GFP^high的肠道干细胞和GFP^low的祖细胞。

注意事项

1. 实验过程中需要用到的PBS应精确配比，高温灭菌并预冷。
2. 实验开始前将需要用到的试剂和培养基准备好，培养基可在4 °C保存不超过2周。
3. B27和N-Acetyl-L-cysteine呈酸性，加入培养基后，培养基颜色呈黄色。
4. 第一次大力手摇后可能大部分都是绒毛，如果镜检时发现隐窝细胞很少可将该组分弃掉，取隐窝细胞富集的组分进行后续实验。
5. 在对隐窝细胞进行消化时，根据细胞量可适当增加消化液体积。隐窝细胞浓度过高会导致在消化过程中死细胞结团，影响细胞得率。
6. 如果离心过程中出现细胞不能完全沉降下来或者贴壁情况，可提前将15 ml和50 ml离心管用FBS或者1% BSA-PBS coating。
7. CD45/Ter119/CD31可选用同一荧光标记的抗体。

溶液配方

1. Basal medium
   Advanced DMEM/F12
   10 mM HEPES
   1× GlutaMax
   1× Penicillin-Streptomycin
   
2. Sorting medium
   Basal medium
   1× N2 supplement
   1× B27 supplement
   1 mM N-Acetyl-L-cysteine
   10 μM Y-27632
   

致谢

陈剑峰实验室的该工作得到了中国科学院大学，生物化学与细胞生物学研究所，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心的大力支持。

参考文献

1. Hamilton, K. E., Crissey, M. A., Lynch, J. P. and Rustgi, A. K. (2015). Culturing adult stem cells from mouse small intestinal crypts. Cold Spring Harb Protoc 4: 354-358.
2. Sato, T. and Clevers, H. (2013). Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol 945: 319-328.
3. Wang, F., Scoville, D., He, X. C., Mahe, M. M., Box, A., Perry, J. M., Smith, N. R., Lei, N. Y., Davies, P. S., Fuller, M. K., Haug, J. S., McClain, M., Gracz, A. D., Ding, S., Stelzner, M., Dunn, J. C., Magness, S. T., Wong, M. H., Martin, M. G., Helmrath, M. and Li, L. (2013). Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology 145(2): 383-395 e1-21.