T细胞增殖的流式检测 (CFSE稀释法)
Analyzing T Cell Proliferation through CFSE Dilution Assay   

材料与试剂

1. Cell strainer 70 μm (Falcon, catalog number: 352350)
2. 96孔细胞培养板 (Jet Biofil, catalog number: 011096)
3. 35 mm细胞培养皿 (Corning, catalog number: 430165)
4. 离心管 (15 ml, 50 ml) (Jet Biofil, catalog number: CFT011150, CFT011550)
5. 移液管 (5 ml, 10 ml) (Jet Biofil, catalog number: GSP010005, GSP010010)
6. 1 ml 注射器 (上海康德莱企业发展集团股份有限公司)
7. TCR转基因OTII小鼠 (Jackson Lab)
8. Anti-CD16/32 (clone 2.4G2) (BioLegend, catalog number: 101301)
9. APC anti-mouse CD3ε (BioLegend, catalog number: 100312)
10. FBS (Gibco, catalog number: 10270)
11. OTII (上海强耀生物科技有限公司合成)
12. IL-2 (北京四环生物制药有限公司，catalog number: 国药准字S10970018)
13. PBS (Hyclone, catalog number: SH30256.01)
14. RPMI-1640 (Hyclone, catalog number: SH30809.01)
15. Penicillin/Streptomycin (Hyclone, catalog number: SV30010)
16. L-Glutamine (Amresco, catalog number: 0374)
17. β-ME (Amresco, catalog number: 0482)
18. CFSE (Invitrogen, catalog number: C1157)
19. DMSO (Sigma-Aldrich, catalog number: 101871790)
20. 10× Lysing buffer (BD Bioscience, catalog number: 555899)
21. NaCl (Sigma-Aldrich, catalog number: V900058-500g)
22. KCl (Sigma-Aldrich, catalog number: V900068-500g)
23. Na₂HPO₄ (Sigma-Aldrich, catalog number: V900060-500g)
24. KH₂PO₄ (Sigma-Aldrich, catalog number: V900041-500g)
25. NaN₃ (Amresco, catalog number: 0639-250g)
26. RPMI完全培养基 (见溶液配方)
27. OTII多肽溶液 (见溶液配方)
28. CFSE溶液 (见溶液配方)
29. 1× lysing buffer (见溶液配方)
30. 10× PBS (1 L, pH = 7.3) (见溶液配方)
31. FACS buffer (见溶液配方)
32. Stain mixture (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 离心机 (Eppendorf, model: Centrifuge 5810)
2. Vortex振荡器 (Kylin-bell)
3. 流式细胞仪 (Beckman Coulter, model: Cytoflex S)
4. 移液器 (Eppendorf)
5. 高压灭菌锅 (Boxun, model: YXQ-LS-100S11)
   

实验步骤

1. 断颈处死小鼠，用70%酒精消毒处理，取出小鼠脾脏，置于70 μm cell strainer上；
2. 将装有脾脏的cell strainer置于35 mm的细胞培养皿中，然后加入4 ml的完全培养基，使用平底的1 ml注射器进行脾脏研磨；
3. 研磨释放脾脏细胞，将脾脏细胞悬液放入50 ml 离心管，再次加入4 ml RPMI完全培养基，冲洗cell strainer，细胞悬液同样放入50 ml 离心管；
4. 450 x g离心5 min，弃去上清；
5. 红细胞裂解，加入2 ml 1× lysing buffer，室温放置2 min.
   注：若脾脏较小，可选择用1 ml 1× lysing buffer，或裂解红细胞1 min。
6. 加入20 ml 1× PBS，中和裂解液，450 x g离心5 min，弃去上清；
7. 细胞计数，用于后续实验，参见视频1;
   
   
   
   视频1. 脾脏研磨获取单细胞悬液
   
   
8. 按照所需要的细胞总量进行细胞重悬：
   若细胞总数小于5 × 10⁷，离心，1 ml 2% FBS/PBS重悬，放置于15 ml离心管中，
   若细胞总数大于5 × 10⁷，离心，PBS重悬至5 × 10⁷/ml，放置于15 ml离心管中；
9. 用1× PBS稀释CFSE至10 μM (2×)；
10. 将等体积的10 μM CFSE加入至待标记的脾脏细胞悬液中，终浓度为5 μM，立即vortex混匀，包上铝箔纸，室温放置7 min；
    注：若细胞量较少，可以降低CFSE浓度，如终浓度降至2 μM，或者减少标记时间至5 min；
11. 加入10 ml RPMI完全培养基，vortex混匀，室温放置2 min，450 x g离心5 min，弃去上清；
12. 重复步骤11；
13. 用含IL-2的RPMI完全培养基重悬脾脏细胞至5 × 10⁶/ml，每孔100 μl加入96孔板，即每孔细胞数为5 × 10⁵，参见视频2；
    
    
    
    视频2. 脾脏细胞CFSE染色
    
    
14. OTII多肽刺激，用含IL-2的RPMI完全培养基稀释OTII至20 μg/ml (2×)，每孔100 μl加入96孔板中，终浓度为10 μg/ml，每孔总体积为200 μl，放入细胞培养箱培养；
    注：设置对照实验，需要同时做：脾脏细胞被CFSE标记且刺激的，即实验组；CFSE标记但不刺激的，用来比较有无刺激T细胞的增殖状况；未标记且刺激的和未标记但不刺激的，用来确定脾脏细胞的荧光本底值，确定阳性范围。
15. 分别在第24 h、48 h、72 h、96 h取细胞用于流式检测，加入150 μl/sample FACS buffer，500 x g，离心 3 min，去上清；
16. 加入50 μl anti-CD16/32 (clone 2.4G2) (200 ng/ml)/sample进行Fc受体封闭, 4 °C放置20 min，封闭结束后，加入150 μl/sample FACS buffer，500 x g，离心 3 min，去上清；
17. 准备流式抗体APC anti-mouse CD3ε，按照0.15 μl APC anti-mouse CD3ε (0.2 mg/ml) + 50 μl FACS buffer/sample稀释抗体；
18. 将稀释好的流式抗体加入样品中，50 μl/sample，vortex混匀，4 °C避光放置25 min；
19. 加入150 μl/sample FACS buffer，500 x g，离心 3 min，去除上清后，60 μl/sample FACS buffer重悬，进行流式检测，参见视频3。
    
    
    
    视频3. 流式样品处理

结果与分析

多肽OTII刺激后进行流式分析，先通过FSC-A, SSC-A确定脾脏细胞群 (样品脾脏细胞都表达CD45，可不染CD45，其他样品可进行CD45染色，确定淋巴细胞群)，再画出T细胞群 (即mouse CD3⁺ 细胞)，选择这群CD3⁺细胞进行CFSE荧光强度分析 (图1)。

图1. 流式检测T细胞CFSE荧光强度

      未被CFSE标记的脾脏细胞样品，选择CD3⁺细胞群分析CFSE荧光强度，如图2：

图2.未标记T细胞CFSE荧光强度

        CFSE标记后的脾脏细胞，选择CD3⁺细胞群分析，左侧图为加入OTII多肽刺激后的流式图，右侧图为无刺激的流式图，从上至下分别为刺激 (左侧) 或培养 (右侧) 24 h、48 h、72 h、96 h的细胞增殖情况，如图3所示：

图3. 流式检测OTII多肽刺激 (左) 与无刺激 (右) T细胞CFSE荧光强度

        OTII刺激脾脏细胞24 h时，未见不同荧光强度的峰，只有单一CFSE高强度峰，此时T细胞还未大量增殖；从第48 h起，开始检测到T细胞分裂，出现三个连续荧光强度的峰；第72 h，在之前的基础上出现一个新的荧光强度低一级的峰 (图3红色箭头所示)；第96 h，又一次出现荧光强度低一级的峰 (图3橙色箭头所示)，原始CFSE高强度的峰逐渐消失 (图3绿色箭头所示)，证明T细胞持续分裂与CFSE标记细胞增殖实验的可行性。
        对比未加入OTII刺激的脾脏细胞，并没有连续CFSE递减的峰出现，说明在无抗原肽刺激的情况下，T细胞增殖不明显。

失败经验

1. 进行CFSE标记时，加入CFSE染料一定要均匀，确保每个细胞标记CFSE的强度一致；
2. 尽量使用原代细胞完成实验，培养时间久的细胞再次刺激分裂能力较弱，CFSE标记后出现递减荧光强度峰的数量会减少；
3. 当细胞数量少时，用2% FBS/PBS重悬细胞，并降低CFSE工作浓度，缩短标记时间，可以减少CFSE对细胞的损伤，保持细胞分裂能力；
4. 若对刚标记完的细胞进行流式检测，会发现CFSE的荧光强度很高但不稳定，18 h后会恢复到稳定的荧光强度；
5. 选择与CFSE (FITC) 无补偿的荧光颜色标记CD3，方便流式检测；
6. 随着T细胞的活化，mouse CD3信号会减弱，选择T细胞群时，需要根据实际读出的CD3的位置画门，确定T细胞群。

溶液配方

1. RPMI完全培养基
   

   RPMI-1640	500 ml
   FBS	60 ml
   Penicillin/Streptomycin	5.5 ml
   L-glutamine (200 mM)	5.5 ml
   β-ME (1 mol/l)	27.5 μl
   IL-2 (105 IU/ml)	280 μl

2. OTII多肽溶液
   用DMSO溶解OTII多肽，至20 mg/ml
3. CFSE溶液
   用DMSO溶解CFSE，至10 mM
4. 1× lysing buffer
   10× lysing buffer用经过高压蒸汽灭菌后的ddH₂O 10倍稀释，即得1× lysing buffer
5. 10× PBS (1 L, pH=7.3)
   

   NaCl	80 g
   KCl	10 g
   Na2HPO4	14.4 g
   KH2PO4	2.4 g

   将上述试剂加入800 ml ddH₂O依次溶解，待所有试剂完全溶解后，加入ddH₂O定容至1 L，高压蒸汽灭菌，冷却后室温保存待用
6. FACS buffer
   

   10× PBS	100 ml
   10× PBS	10 ml
   NaN3 (20%)	2.5 ml

   使用量筒量取100 ml 10× PBS，加入800 ml ddH₂O进行稀释，再加入10 ml FBS和2.5 ml NaN₃ (20%)，混合均匀后，加入ddH₂O定容至1 L，放入4 °C冰箱备用
7. Stain mixture
   

   APC anti-mouse CD3ε (0.2 mg/ml)	0.15 μl
   FACS buffer	50 μl

   按照每个样品50 μl准备stain mixture，50 μl FACS buffer加入0.15 μl流式抗体APC anti-mouse CD3ε (0.2 mg/ml)，混匀备用
   

致谢

感谢杨选明实验室全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然基金 (81671643)、科技部重点研发计划 (2016YFC1303400) 资助。

参考文献

1. Fulcher, D. and Wong, S. (1999). Carboxyfluorescein succinimidyl ester-based proliferative assays for assessment of T cell function in the diagnostic laboratory. Immunol Cell Biol 77(6): 559-564.
   
2. Quah, B. J., Warren, H. S. and Parish, C. R. (2007). Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc 2(9): 2049-2056.