摘要:T细胞经过抗原刺激活化后,会发生一系列的变化 (Yang等,2014a和2014b; Pu等,2016),如表达表面活性分子、产生特定的细胞因子、细胞增殖分裂及细胞凋亡等,利用流式细胞仪可以在单细胞水平上对其进行多参数检测 (Yang等,2014b),如:活化T细胞的表面分子 (如CD44、CD69等) 及其相应的效应分子 (如Granzyme B、IFN-γ及Perforin等),从而对抗原特异性免疫反应在细胞水平进行定性和定量分析。本次实验中,我们利用含OVA模式抗原的小鼠黑色素瘤细胞B16-OVA对OT-IT细胞给予刺激,24h后检测胞内细胞因子IFN-γ的表达,对照组OT-IT细胞无肿瘤细胞刺激。
关键词: 流式检测, T细胞活化, 细胞因子, 胞内染色
材料与试剂
- 96孔板 (Jet Biofil, catalog number: TCP001096)
- OT-I小鼠 (Jackson Lab)
- Anti-mCD8-AF700 (BioLegend, catalog number: 100730)
- Anti-IFN-γ-APC (BioLegend, catalog number: 505810)
- anti-CD16/32 抗体 (clone 2.4G2) (BioLegend, catalog number: 101301)
- B16-OVA细胞 (芝加哥大学Hans Schreiber馈赠)
- FBS (Gibco, catalog number: 10270-106)
- PBS (Hyclone, catalog number: SH30256.01B)
- RPMI 1640培养基 (Hyclone, catalog number: SH30027.01)
- 双抗Penicillin/Streptomycin (Hyclone, catalog number: SV30010)
- 10x Permeabilization Buffer (eBioscience, catalog number: 00-8333-56)
- BFA (Brefeldin A) (BioLegend, catalog number: 420601)
- 多聚甲醛 (Adamas, catalog number: 46556A)
- NaCl (Sigma-Aldrich, catalog number:V900058-500g)
- KCl (Sigma-Aldrich, catalog number:V900068-500g)
- Na2HPO4 (Sigma-Aldrich, catalog number:V900060-500g)
- KH2PO4 (Sigma-Aldrich, catalog number:V900041-500g)
- NaN3 (Amresco, catalog number: 0639-250g)
- NaOH (Sigma-Aldrich, catalog number: V900797)
- 10× PBS (1 L, pH = 7.3) (见溶液配方)
- FACS buffer (见溶液配方)
- 4%多聚甲醛 (见溶液配方)
仪器设备
- 生物安全柜 (LabGard, model: Class II/Labconco)
- 离心机 (Eppendorf, model: 5810R)
- 光学显微镜 (Olympus, model: IX2-SLP)
- 流式细胞仪 (Backman Coulter, model: CytoFLEX S)
- 移液器 (Eppendorf)
- 二氧化碳培养箱 (Panasonic, model: MCO-20AIC)
- 高压蒸汽灭菌锅 (Boxun,model: YXQ-LS-100SII)
软件
- FlowJo 软件
实验步骤
- 获取OT-I小鼠的脾脏细胞,计数,按照1 × 105~2 × 105接种于96孔板,培养基为含IL-2的RPMI完全培养基,按照 (OT-I小鼠的脾脏细胞:B16-OVA肿瘤细胞) E:T = 3:1的比例加入B16-OVA肿瘤细胞刺激,对照组不加肿瘤细胞;
- 刺激后约20 h,加入BFA反应2.5 h~4 h,用排枪吸取悬浮细胞悬液加入新的96孔板 (U型),500 x g离心3 min,弃去上清;
- 加入FACS buffer,200 μl/sample,500 x g离心3 min,弃去上清;
- 细胞表面分子染色,单份样品抗体用量如下,按照50 μl/sample加入样品,适度混匀,4 °C孵育25 min:
25 μl FACS buffer
25 μl 2.4G2 (200 ng/ml)
0.15 μl anti-mCD8-AF700; - 加入FACS buffer 150 μl/sample,500 x g离心3 min,弃去上清;
- 重复第5步;
- 细胞固定,按照100 μl/sample标准加入4% PFA固定,加入后立即使用移液器反复吹打混匀防止细胞结块,室温孵育15 min;
- 加入FACS buffer 150 μl/sample,500 x g离心3 min,弃去上清;
- 重复第8步;
- 破膜处理,新鲜配制1× Permeabilization Buffer,按照200 μl/sample加入1× Permeabilization Buffer,用移液器吹打重悬细胞,室温15 min,破膜完成后,500 x g,离心3 min,去上清;
- 胞内细胞因子染色,单份样品抗体用量如下,并按照50 μl/sample加入样品,适度混匀,4 °C孵育25 min:
50 μl 1x Permeabilization Buffer
0.15 μl anti-IFN-γ-APC; - 加入1× Permeabilization Buffer 150 μl/sample,500 x g离心3 min,弃去上清;
- 用FACS buffer 重悬样品 (70 μl/sample),将样品置于冰上;
- 使用流式细胞仪分析获取数据,利用FlowJo 软件分析流式检测结果。
结果与分析
胞内染色法检测T细胞活化引起的IFN-γ的表达情况
结果分析:图1A通过FSC-A和SSC-A分析排除死细胞和细胞碎片,确定和收集主要细胞群;图1B进一步通过APC-A700-A染色确定CD8+ T细胞;图1C~1D在图1B基础上通过APC-A染色确定IFN-γ的表达。
图1. 胞内染色检测活化T细胞释放IFN-γ的情况
注意事项
- 该实验中的200 ng/ml为2.4G2抗体最终浓度;抗体Anti-mCD8-AF700及Anti-IFN-γ- APC具有光谱重叠需要预先在流式细胞仪上调好补偿,多色共染时对于抗体的选择需要注意,要尽量减少光谱重叠,例如两色共染时可选择APC + FITC标记或者APC + AF488标记,这样可以有效避免光谱重叠。
- 本实验中也可以收集24 h时细胞上清,利用ELISA或CBA的方法检测上清中分泌IFN-γ的表达,胞内染色的优点在于能够明确产生IFN-γ的细胞类型,此外,其他效应分子如Granzyme B、Perforin及TNF-α等也可以用同样的胞内染色方法进行流式检测。
溶液配方
- 10× PBS (1 L, pH=7.3)
NaCl
| 80 g
|
KCl
| 10 g
|
Na2HPO4
| 14.4 g
|
KH2PO4
| 2.4 g |
将上述试剂加入800 ml ddH2O依次进行溶解,待所有试剂完全溶解后,高温湿热灭菌,冷却后室温保存待用 - FACS buffer
10× PBS
| 100 ml
|
FBS
| 10 ml
|
20% NaN3
| 2.5 ml |
使用量筒取100 ml 10× PBS,首先加入800 ml ddH2O进行稀释,再加入10 ml FBS和2.5 ml 20% NaN3,混合均匀后,加入ddH2O定容至1 L,4 °C备用 - 4%多聚甲醛
称量4.0 g多聚甲醛,先加入80 ml已配制好的1× PBS在60~65 °C加热搅拌溶解,20分钟后,使用NaOH调节pH至7.0,待溶液呈现清亮,无未溶解固体成分,加入PBS定容至100 ml,避光保存于4 °C待用
注:甲醛具有较强的毒性,注意做好防护措施。
致谢
感谢杨选明实验室全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然基金 (81671643)、科技部重点研发计划 (2016YFC1303400) 资助。本实验方案用于已发表的文章Han 等,2019;Qi等,2019;Zhang等2019。
参考文献
- Han, P., Dai, Q., Fan, L., Lin, H., Zhang, X., Li, F. and Yang, X. (2019). Genome-wide CRISPR screening identifies JAK1 deficiency as a mechanism of T-Cell resistance. Front Immunol 10: 251.
- Pu, Y., Xu, M., Liang, Y., Yang, K., Guo, Y., Yang, X. and Fu, Y. X. (2016). Androgen receptor antagonists compromise T cell response against prostate cancer leading to early tumor relapse. Sci Transl Med 8(333): 333ra347.
- Qi, X., Li, F., Wu, Y., Cheng, C., Han, P., Wang, J. and Yang, X. (2019). Optimization of 4-1BB antibody for cancer immunotherapy by balancing agonistic strength with FcgammaR affinity. Nat Commun 10(1): 2141.
- Yang, X., Zhang, X., Fu, M. L., Weichselbaum, R. R., Gajewski, T. F., Guo, Y. and Fu, Y. X. (2014a). Targeting the tumor microenvironment with interferon-beta bridges innate and adaptive immune responses. Cancer Cell 25(1): 37-48.
- Yang, X., Zhang, X., Sun, Y., Tu, T., Fu, M. L., Miller, M. and Fu, Y. X. (2014b). A BTLA-mediated bait and switch strategy permits Listeria expansion in CD8α(+) DCs to promote long-term T cell responses. Cell Host Microbe 16(1): 68-80.
- Zhang, X., Cheng, C., Hou, J., Qi, X., Wang, X., Han, P. and Yang, X. (2019). Distinct contribution of PD-L1 suppression by spatial expression of PD-L1 on tumor and non-tumor cells. Cell Mol Immunol 16(4): 392-400.
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:韩萍, 杨选明. (2019). 胞内染色法检测T细胞活化产生的细胞因子.
Bio-101: e1010314. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010314.
How to cite: Han, P. and Yang, X. M. (2019). Analyzing Cytokines Production during T Cell Activation by Flow Cytometry Intracellular Staining.
Bio-101: e1010314. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010314.