摘要:固有淋巴样细胞是近年来新发现的一群缺乏T、B细胞抗原特异性受体的天然免疫细胞亚群,主要分布在器官和黏膜组织,对维持组织免疫稳态具有重要调节作用,而其功能异常可导致组织炎症性疾病如炎症性肠病和哮喘等疾病的发生。目前关于这类细胞的发育调控、组织特异性、以及细胞命运的可塑性等方面还没有完全研究清楚,因此本实验基于肠道富含各种固有淋巴样细胞亚群,拟通过多色流式染色技术,建立分析肠道固有层固有淋巴样细胞三个亚群组成及深度解析细胞表型的方法。
关键词: 固有淋巴样细胞, 表型检测, 多色流式染色分析技术
材料与试剂
材料:
仪器设备
实验步骤
一.分离肠道固有层淋巴细胞
结果与分析
图4. 小鼠大肠固有层固有淋巴样细胞亚群分布. 根据FSC、SSC即细胞的大小和所含内容物多少可圈出淋巴细胞,根据FSC-A和FSC-H可圈出单细胞群。Lineage-CD45.2+CD127+CD90.2+可定义出总固有淋巴样细胞,其中T-bet+是ILC1,RORγt+是ILC3,GATA3+是ILC2。ILC1占lineage-固有淋巴样细胞17.7%,ILC2占lineage-固有淋巴样细胞44.4%,ILC3占lineage-固有淋巴样细胞32.1%,还存在5.8%未知淋巴细胞。图5. 小鼠小肠固有层固有淋巴样细胞亚群分布. 小肠中固有淋巴样细胞的亚群分布与大肠略有不同,其中ILC1占lineage-固有淋巴样细胞12.1%,ILC2占lineage-固有淋巴样细胞15.8%,ILC3占lineage-固有淋巴样细胞68.2%,还存在3.9%未知淋巴细胞。分离得到肠道固有层淋巴细胞后,可以在显微镜下观察计数,通过细胞的形状和台盼蓝染色判断制备细胞的状态。细胞活力高、状态好,方可进行后续的流式染色分析。固有淋巴样细胞主要居留在粘膜组织中,其中肠道固有层存在大量的ILC1、ILC2、ILC3。依据其不同亚群的分类标准,此次实验中,我们圈出lineage- (即CD3-B220-CD11b-CD11c-Gr-1-) CD45.2+CD90.2+CD127+的淋巴细胞单细胞群,其中,T-bet+为ILC1,RORγt+为ILC3,GATA3+为ILC2。已知ILC3具有较高的异质性,部分ILC3由于外界共生菌和Ahr信号的刺激,会上调T-bet的表达,并拥有产生IFNγ的能力 (Zook和Kee,2016)。因此可以发现,在图4中,我们定义的RORγt+ILC3亚群可分为T-bet+和T-bet-两群。另外,ILC2表面高表达IL-2受体CD25、IL-33受体ST2、IL-25受体IL-17RB等,在常见的哮喘、过敏等二型免疫反应中,ILC2会接受上游IL-33、IL-25、TSLP等信号的刺激后活化,大量分泌二型细胞因子IL-5、IL-13等参与下游反应发挥功能 (Sonnenberg和Artis,2015)。因此在图4中,我们还观察了ILC2表面CD25的表达情况,发现肠道ILC2均高表达CD25。图4和图5分别展示了大小肠中固有淋巴样细胞的亚群分布,比较两图可知,大肠中的固有淋巴样细胞以ILC2为主,而小肠中的固有淋巴样细胞以ILC3为主。如果条件允许,实验者还可以加入各种感兴趣的细胞标记蛋白抗体,从而探索不同固有淋巴样细胞亚群的蛋白表达谱。图6. 肠道二型固有淋巴样细胞表型分析. 所有流式图的细胞来自lineage-CD45.2+CD90.2+CD127+淋巴细胞单细胞群。 以二型固有淋巴样细胞为例,在图6中,我们观察了ILC2表面包括ST2、IL-17RB、CD25、KLRG1、CD69、MHC II等在内的不同蛋白的表达情况。之所以选择观察这些蛋白,主要是因为它们与ILC2的功能和状态相关:ST2、IL-17RB和CD25分别为ILC2感受上游信号IL-33,IL-25和IL-22的受体,CD69、KLRG1蛋白可判断细胞处于激活还是抑制状态,MHC II则与适应性免疫应答息息相关。其中ST2、CD25、KLRG1、CD69等均在ILC2表面高表达,与已有的文献报道一致;部分ILC2高表达MHC II,提示ILC2可作为抗原递呈细胞与辅助T细胞相互作用。除此以外,根据已有的研究发现,ILC2还表达OX40、PD-1等蛋白,参与适应性免疫调控等多种生理过程,本文不再一一描述,实验者可根据实验目的自行调整染色方案,检测固有淋巴样细胞的表型。
失败经验
溶液配方
致谢
感谢沈蕾实验室和中科院邱菊实验室各位研究生同学对本实验方法的帮助和改进。本实验得到国家自然科学基金项目 (81571533) 的资助。
参考文献
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