小鼠骨髓与骨内膜间充质干细胞分析
Flow Cytometry Analysis of Mouse Bone Marrow and Endosteum Mesenchymal Stromal Cells   

材料与试剂

1. 15 ml离心管
2. 1.5 ml EP管
3. 70 μm滤膜 (Fisherbrand, catalog number: 22363548)
4. 小鼠 (C57BL/6J，6~8周龄，雄雌各半)
5. 胎牛血清 (FBS, Gibco, catalog number: 10100147)
6. Liberase (Roche, catalog number: 5401020001)
7. DNase I (Roche, catalog number: 10104159001)
8. 流式抗体如表1
   
   表1. 流式抗体
   
   
   
9. 同型对照抗体如表 2
   
   表2. 同型对照抗体
   
   
   
10. 磷酸缓冲液 (10x PBS, Sangon biotech, catalog number: E607016-0500)
11. 氯化铵 (天津大茂化学，catalog number: 12125-02-9)
12. 碳酸氢钠 (Sigma-Aldrich, catalog number: S5761，500G)
13. EDTA粉末 (鼎国，catalog number: LE568)
14. 7-AAD (Biolegend, catalog number: 420404, 50 µg/ml)
15. HBSS (Corning, catalog number: 26616008)
16. MSC消化酶 (见溶液配方)
17. 磷酸缓冲液 (1x PBS) (见溶液配方)
18. 红细胞裂解液 (500 ml) (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 离心机 (Eppendorf, catalog numbers: 5804R, 5424R)
2. 移液器
3. 水浴锅
4. 恒温摇床
5. 摇床
6. 流式细胞仪 (Thermo fisher scientific, Attune NxT)
   

实验步骤

1. 37 °C水浴预热MSC消化酶 (配制方法见“溶液配方”部分)，37 °C预热摇床，冰上预冷PBS + 2% FBS。
2. 颈椎脱臼处死小鼠，从下腹部剪开小鼠腿部皮肤，小心剪开髋关节与踝关节，将小鼠腿部完整取出，分离肌肉，取出股骨与胫骨，浸泡在预冷的PBS + 2% FBS中，置于冰上。 
3. 骨髓、骨内膜MSC取材
   
   3.1

   骨髓MSC取材：小心沿骨骺剪开松质骨部分 (图1，沿虚线部分剪开)，用1 ml注射器吸取0.5 ml预冷的PBS + 2% FBS，将骨髓组织完整冲出至1.5 ml EP管中，1条股骨与1条胫骨骨髓置于同一个EP管中，冰上静置5 min，吸去多余PBS。每管骨髓组织加入750 μl预热的MSC消化酶，轻轻颠倒后置于37 °C水浴锅中10 min，期间拿起颠倒数次。
   3.2

   骨内膜MSC取材：冲出骨髓后剩下的1条股骨与1条胫骨骨组织置于PBS + 2% FBS中，仔细剪碎骨组织，剪碎至骨髓腔完全暴露，且碎片面积小于5 mm² (图2)，将骨组织置于750 μl预热的MSC消化酶中，轻轻颠倒后置于37 °C水浴锅中10 min，期间拿起颠倒数次。
4. 将上述骨髓组织或骨组织与消化酶的混合物侧放于37 °C 160~220 rpm摇床中，消化20 min。
5. 消化后室温静置5 min，取上清约700 μl消化液加入至10 ml预冷PBS + 2% FBS进行中和，注意不要吸取未消化的骨髓组织。
6. 骨髓组织或骨组织中再加入750 μl预热的MSC消化酶，重复第4、5步进行第2次消化，消化后尽量吸净消化液，加入至第5步的中和后消化液中。
7. 将2次消化后的中和后消化液于4 °C 500 x g离心5 min，弃去上清，每管加入1 ml红细胞裂解液，重悬骨髓组织，用移液枪轻柔吹打均匀，37 °C静置5 min后加入10 ml的预冷的PBS + 2% FBS终止裂解，每管细胞准备1个新的50 ml离心管，将1个70 μm滤器置于离心管上，将上述终止裂解后的11 ml细胞悬液分次倾倒至滤器中，过滤至50 ml离心管中。4 °C 500 x g离心5 min，弃去上清。
8. 用适当体积预冷的PBS + 2% FBS重悬沉淀，用细胞计数板或流式细胞仪进行细胞计数。
9. 取3份3 × 10⁶细胞，调整至150 μl体积，加入2 μl (0.5 mg/ml) Purified CD16/32，置于冰上、80 rpm摇床上封闭30 min。
10. 其中1份细胞封闭后各加入1 μl以下抗体：Ter-119-APC，CD45-APC，Pdgfrα-SuperBright 436，LepR-biotin，加入0.2 μl CD31-PE/Cy7；1份细胞封闭后加入1 μl以下抗体：Ter-119-APC-iso，CD45-APC-iso，Pdgfrα-SuperBright 436，LepR-biotin; 另1份细胞封闭后加入1 μl以下抗体：Ter-119-APC，CD45-APC，Pdgfrα-SuperBright 436-iso，LepR-biotin-iso。以上3份细胞避光置于冰上、80 rpm摇床上孵育1 h。
11. 分别加入1 ml PBS + 2% FBS终止染色，500 x g离心5 min，弃去上清，150 μl预冷的PBS + 2%FBS重悬，加入1 μl (0.2 mg/ml) Streptavidin- APC/Cy7，置于冰上、80 rpm摇床上孵育30 min。
12. 分别加入1 ml PBS + 2% FBS终止染色，500 x g离心5 min，弃去上清，400 μl预冷的PBS + 2% FBS重悬，每管加入5 μl (50 µg/ml) 7-AAD，混匀后使用流式细胞仪收集数据。
    

结果与分析

小鼠骨髓MSCs在Pdgfrα⁺和LepR⁺的细胞中富集，也有部分骨髓来源的MSC表达CD51，并且上述3个标记物有较高的共表达比例 (Morikawa等，2009; Zhou等，2014; Yue等，2016)。还有报道发现，Nestin-GFP (Mendez-Ferrer等，2010)，Gli1-cre (Zhao等，2014; Schneider等，2017)，Gremlin 1 (Worthley等，2015) 和N-cadherin (Zhao等，2019) 可富集骨髓MSCs，但这些分子标记物需要依赖荧光报告工具小鼠，故在此不介绍具体方法。在此，我们使用的小鼠骨髓和骨内膜间充质干细胞的标志为CD45^-Ter-119^- CD31^- LepR⁺或CD45^- Ter-119^- CD31^- Pdgfrα⁺ 。
        图3为同型对照的结果及画门标准，图4和图5分别为骨髓和骨内膜间充质干细胞分析流式图和画门方法。首先以FSC-A 和SSC-A 为轴，画出主要细胞群，然后以FSC-A 和FSC-H去除粘连细胞，画出单个细胞群，再根据7-AAD画出活细胞群(7-AAD^-)。接下来根据实验需要画出CD45^- Ter-119^- CD31^- LepR⁺和CD45^- Ter-119^- CD31^- Pdgfrα⁺细胞群，由流式结果可以得出，在骨髓和骨内膜MSC中LepR和Pdgfrα均有较高的共表达比例。


图1. 小鼠股骨 (左)与胫骨 (右)，虚线表示剪开的地方


图2. 骨内膜MSC取材示意图


图3. LepR 与Pdgfrα同型对照结果及画门标准


图4. 小鼠骨髓间充质干细胞分析流式图


图5. 小鼠骨内膜间充质干细胞分析流式图

失败经验

骨髓组织未被消化：

1. 消化酶活性丧失。
   *MSC消化酶配好后-20 °C冰箱保存，尽快使用。
2. 消化未在37 °C 160~220 rpm摇床中进行。
   *需保证震荡的转速达160~220 rpm及消化时温度维持至37 °C。
   
   

无明显MSC分群：

1. 消化过度或不足。
   *适当调整消化时间，消化骨髓组织时消化至没有肉眼可见骨髓组织为宜。
2. 消化酶活性不足。
   *Liberase干粉-20 °C冰箱保存，MSC消化酶配好后-20 °C冰箱保存，尽快使用。
   *MSC消化酶使用前需在37 °C先预热，加入骨髓组织后先在37 °C水浴锅中孵育10 min，摇床需提前设定37 °C，保证震荡消化时温度维持至37 °C。
3. DNase I 未添加或浓度不够。
   *DNase I的作用为消化细胞破裂后释放的游离DNA，过多的游离DNA会缠绕细胞，导致消化不充分。但不同批号DNase I的质量与活性单位的换算比例不同，此处使用Roche公司DNase I (10104159001)。
4. 使用了无钙离子的HBSS。
   *DNase I 需在钙离子存在下发挥消化作用，故需使用添加了钙离子的HBSS。
5. 一抗或二抗浓度过低。
   *适当提高抗体浓度。
6. 抗体孵育时间过短。
   *适当延长孵育时间。
7. 置于室温孵育。
   *置于室温孵育易导致非特异结合增加，应置于冰上摇床孵育。
8. 置于4 °C冰箱静置孵育。
   *应在约80 rpm摇床中孵育。
   

溶液配方

1. MSC消化酶
   Liberase 5 mg
   DNase I 250 μl (20 mg/ml) 溶于25 ml HBSS
   -20 °C保存
2. 磷酸缓冲液 (1x PBS)
   使用去离子水稀释PBS (10x) (去除钙、镁离子) 至1x
3. 红细胞裂解液 (500 ml)
   氯化铵         4.15 g
   碳酸氢钠     500 mg
   EDTA (粉末)18.5 mg
   使用去离子水定容至500 ml，4 °C保存
   

参考文献

1. Mendez-Ferrer，S.，Michurina，T. V.，Ferraro，F.，Mazloom，A. R.，Macarthur，B. D.，Lira，S. A.，Scadden，D. T.，Ma'ayan，A.，Enikolopov，G. N. and Frenette，P. S. (2010). Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature 466(7308): 829-834.
2. Morikawa，S.，Mabuchi，Y.，Kubota，Y.，Nagai，Y.，Niibe，K.，Hiratsu，E.，Suzuki，S.，Miyauchi-Hara，C.，Nagoshi，N.，Sunabori，T.，Shimmura，S.，Miyawaki，A.，Nakagawa，T.，Suda，T.，Okano，H. and Matsuzaki，Y. (2009). Prospective identification，isolation，and systemic transplantation of multipotent mesenchymal stem cells in murine bone marrow. J Exp Med 206(11): 2483-2496.
3. Schneider，R. K.，Mullally，A.，Dugourd，A.，Peisker，F.，Hoogenboezem，R.，Van Strien，P. M. H.，Bindels，E. M.，Heckl，D.，Busche，G.，Fleck，D.，Muller-Newen，G.，Wongboonsin，J.，Ventura Ferreira，M.，Puelles，V. G.，Saez-Rodriguez，J.，Ebert，B. L.，Humphreys，B. D. and Kramann，R. (2017). Gli1⁺ mesenchymal stromal cells are a key driver of bone marrow fibrosis and an important cellular therapeutic target. Cell Stem Cell 20(6): 785-800 e788.
4. Worthley，D. L.，Churchill，M.，Compton，J. T.，Tailor，Y.，Rao，M.，Si，Y.，Levin，D.，Schwartz，M. G.，Uygur，A.，Hayakawa，Y.，Gross，S.，Renz，B. W.，Setlik，W.，Martinez，A. N.，Chen，X.，Nizami，S.，Lee，H. G.，Kang，H. P.，Caldwell，J. M.，Asfaha，S.，Westphalen，C. B.，Graham，T.，Jin，G.，Nagar，K.，Wang，H.，Kheirbek，M. A.，Kolhe，A.，Carpenter，J.，Glaire，M.，Nair，A.，Renders，S.，Manieri，N.，Muthupalani，S.，Fox，J. G.，Reichert，M.，Giraud，A. S.，Schwabe，R. F.，Pradere，J. P.，Walton，K.，Prakash，A.，Gumucio，D.，Rustgi，A. K.，Stappenbeck，T. S.，Friedman，R. A.，Gershon，M. D.，Sims，P.，Grikscheit，T.，Lee，F. Y.，Karsenty，G.，Mukherjee，S. and Wang，T. C. (2015). Gremlin 1 identifies a skeletal stem cell with bone，cartilage，and reticular stromal potential. Cell 160(1-2): 269-284.
5. Yue，R.，Zhou，B. O.，Shimada，I. S.，Zhao，Z. and Morrison，S. J. (2016). Leptin receptor promotes adipogenesis and reduces osteogenesis by regulating mesenchymal stromal cells in adult bone Marrow. Cell Stem Cell 18(6): 782-796.
6. Zhao，H.，Feng，J.，Seidel，K.，Shi，S.，Klein，O.，Sharpe，P. and Chai，Y. (2014). Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell 14(2): 160-173.
7. Zhao，M.，Tao，F.，Venkatraman，A.，Li，Z.，Smith，S. E.，Unruh，J.，Chen，S.，Ward，C.，Qian，P.，Perry，J. M.，Marshall，H.，Wang，J.，He，X. C. and Li，L. (2019). N-cadherin-expressing bone and marrow stromal progenitor cells maintain reserve hematopoietic stem cells. Cell Rep 26(3): 652-669 e656.
   
8. Zhou，B. O.，Yue，R.，Murphy，M. M.，Peyer，J. G. and Morrison，S. J. (2014). Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell 15(2): 154-168.