海洋细菌活性和膜完整性的流式检测
Assessment of the Bacterial Cell Viability and Membrane Integrity in Marine Bacteria by Flow Cytometry   

材料与试剂

1. 70 μm细胞过滤器 (Beyogold, catalog number: FSTR040)
2. 流式管 (BD Falcon, catalog number: BD 352054)
3. 5-氰基-2,3-二甲苯基四氮唑 (CTC) (Seebio, catalog number: 182066)
4. 碘化丙啶 (PI) (Solarbio, catalog number: P8080)
5. PBS (pH = 7.2~7.4, Solarbio, catalog number: P1020)
6. CTC溶液 (见溶液配方)
7. PI溶液 (见溶液配方)
   

仪器设备

1. 流式细胞仪 (美国BD公司，model: FACS AriaIII) 
2. 低速离心机 (中科中佳科学仪器公司，model: LX-200)
3. 小型低温高速离心机 (德国Eppendorf公司，model: 5424R)
4. -80 °C冰箱 (中国海尔集团，model: DW-86L388)
   

实验步骤

1. 在福建附近海域，依据采水标准层次采取50~200 ml水样。采水器上的采样瓶、采样袋及实验室内样品处理过程均需无菌操作。
2. 水样用70 μm滤膜过滤，去除杂质，以免堵塞流式细胞仪。
3. 过滤后的水样于5,000 x g 室温离心10 min，小心去除上清，收集沉淀, 若无明显沉淀可留取离心管底部液体用于后续实验。
4. 沉淀用400 μl PBS重悬，均匀分为2管。一管中加入CTC染料，使其终浓度达到2 mmol/L，37 °C避光孵育3 h (林等，2013；Zhang等，2018)；另一管中加入1 μl PI染料，室温避光孵育10 min (Nescerecka等，2016)。
5. 分别于2管菌液中加入4 ml PBS重悬，5,000 x g 室温离心10 min，小心吸弃上清。
6. 预留200 μl溶液上机检测。
7. 在流式细胞仪上，先用未染色的细菌悬液设置检测参数，调节检测电压和阴性，所用激光器为488激光器。根据前向散射光 (Forward scatter, FSC，主要反映被测样品的大小) 和侧向散射光 (side scatter, SSC，主要反映被测样品所含内容物的多少) 排除大于1 μm的藻类和其他生物的影响，根据是否自发荧光排除微藻的影响，上机检测至少获取1 × 10⁵ 的阳性细胞做后续数据分析。
8. CTC (激发波长480 nm，发射波长630 nm，荧光信号位于FL3通道) 可以与活性菌反应，在细胞内形成红色物质，代谢活性越强的细菌，产生红色荧光越强，从而通过流式细胞仪识别检测细菌的活性。
9. 随着细菌的凋亡和坏死，细菌细胞膜的通透性逐渐增大，PI染料 (激发波长480nm，发射波长620 nm，荧光信号位于FL3通道) 可以穿过细胞膜与细胞内DNA结合，通过流式细胞仪检测PI的荧光强度，判断细菌细胞膜的完整性 (Shahryari等，2018)。
   

结果与分析

如图1所示，横坐标表示bis-oxonol荧光强度，bis-oxonol表示细胞的去极化水平，在海水中培养，细胞膜通透性变大，去极化水平升高，bis-oxonol的荧光强度越强 (图1C)，纵坐标表示CTC的荧光强度，在海水中加入营养成分，细胞呼吸活性增强，CTC荧光增强 (图1D) (Lopez-Amoros等，1997)。


图1. 大肠杆菌在海水中饥饿状态和加入营养成分呼吸活性和细胞膜去极化水平检测. 大肠杆菌培养在海水中，在是否存在营养成分的条件下培养，收集菌液，CTC和bis-oxonol染色。横坐标表示bis-oxonol荧光强度，纵坐标表示CTC的荧光强度，流式图以等高线图显示，密度代表细胞数量(Lopez-Amoros等，1997)。

如图2所示，横坐标为Annexin V的荧光强度，Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸 (PS) 由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。纵坐标为PI的荧光强度，即死细胞的含量，Q1为PI阳性区域。当细胞膜完整时，PI染料很难透过细胞膜与胞内DNA结合，Q1区域阳性细胞很少 (图1 在buffer溶液中的细胞)；当细胞膜破损，PI可以通过细胞膜与死细胞内的核酸结合，PI阳性的细胞增多 (图1中经Cu²⁺、KCTD1、KCTD1+ Cu²⁺处理的细胞)，因此，可通过PI阳性的多少检测细胞膜的完整性 (Liu等，2016)。


图2. KCTD1在Cu²⁺存在条件下发生聚集引起更多的细胞凋亡. 将0.4 μg/μl的KCTD1蛋白单独或与20 μM CuSO₄ 于37 °C共孵育2 h后加入Huh7细胞培养基中培养36 h后收集细胞，于Annexin-V 和PI共染色后流式检测细胞凋亡情况。横坐标Annexin V代表早期凋亡的细胞 (Q3区域)，纵坐标PI代表细胞膜破损后死亡的细胞 (Q1区域)，Q2代表晚期凋亡的细胞 (Liu等，2016)。

溶液配方

1. CTC溶液
   用无菌水将CTC染料配制成浓度为 10 mmol/L的储存液，避光-20 °C保存，使用浓度为2 mmol/L
2. PI溶液
   用1 ml无菌水将10 mg PI粉末配制成浓度为10 mg/ml的储存液，-20 °C冰箱避光保存，使用浓度为50 μg/ml
   

致谢

本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金项目 (资助号：81703555，81773063，U1505225和81273548)、国家重点基础研究发展计划 (973计划) 项目 (资助号：2015CB931804)、中国大洋专项课题 (资助号：DY135-2-13)、福建省科技厅平台项目 (资助号：2018N2001)、教育厅平台项目和中国博士后科学基金 (资助号：2017M620268)的经费支持。

参考文献

1. 林怡雯，杨天，李丹，等. (2013) 基于CTC-流式细胞仪活性细菌总数的快速检测技术研究．环境科学学报，33( 9): 2511-2515.
2. Liu, Z., Song, F., Ma, Z. L., Xiong, Q., Wang, J., Guo, D. and Sun, G. (2016). Bivalent copper ions promote fibrillar aggregation of KCTD1 and induce cytotoxicity. Sci Rep 6: 32658.
3. Lopez-Amoros, R., Castel, S., Comas-Riu, J. and Vives-Rego, J. (1997). Assessment of E. coli and Salmonella viability and starvation by confocal laser microscopy and flow cytometry using rhodamine 123, DiBAC4(3), propidium iodide, and CTC. Cytometry 29(4): 298-305.
4. Nescerecka, A., Hammes, F. and Juhna, T. (2016). A pipeline for developing and testing staining protocols for flow cytometry, demonstrated with SYBR Green I and propidium iodide viability staining. J Microbiol Methods 131: 172-180.
5. Shahryari, S., Zahiri, H. S., Haghbeen, K., Adrian, L. and Noghabi, K. A. (2018). High phenol degradation capacity of a newly characterized Acinetobacter sp. SA01: Bacterial cell viability and membrane impairment in respect to the phenol toxicity. Ecotoxicol Environ Saf 164: 455-466.
6. Zhang S, Guo L, Yang K, Zhang Y, Ye C, Chen S, Yu X, Huang WE, Cui L. (2018). Induction of Escherichia coli into a vbnc state by continuous-flow uvc and subsequent changes in metabolic activity at the single-cell level. Front Microbiol 9:2243.