海洋微藻中脂质体含量的流式检测
Flow Cytometric Determination of Lipid Content in Marine Microalgae   

材料与试剂

1. 70 μm细胞过滤器 (Beyogold, catalog number: FSTR040)
2. 流式管 (BD Falcon, catalog number: BD 352054)
3. 斜生栅藻 (Scenedesmus obliquus，JNU20)
4. 尼罗红 (Solarbio, catalog number: N8440)
5. PBS (pH = 7.2~7.4, Solarbio, catalog number: P1020)
6. DMSO (Solarbio, catalog number: D8370)
7. 硝酸钠
8. 磷酸氢二钾
9. 七水硫酸镁 
10. 二水氯化钙
11. 柠檬酸
12. 柠檬酸铁铵 
13. EDTA二钠
14. 碳酸钠
15. 硼酸
16.  四水氯化锰
17. 七水硫酸锌
18. 二水钼酸钠
19. 五水硫酸铜
20.  六水硝酸钴
    
21. 盐酸
22. 氯仿
23. 尼罗红试剂 (见溶液配方)
24. BG-11培养基 (见溶液配方)
25. 1,000x 微量元素 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 柱光生物反应器 (ψ3 cm × 30 cm, 玻璃材质)
2. 微波炉 (美的，model: M1-211A)
3. 高压灭菌锅 (德国爱安姆高压灭菌器，model: L65)
4. 流式细胞仪 (美国BD公司，model: FACS AriaIII)
5. 低速离心机 (中科中佳科学仪器公司，model: LX-200)
6. 小型低温高速离心机 (德国Eppendorf公司，model: 5424R)
7. -80 °C冰箱 (中国海尔集团，model: DW-86L388)
   

实验步骤

1. 以斜生栅藻 (Scenedesmus obliquus，JNU20) 为实验样品，培养于含0.5 g/L NaNO₃的BG-11基础培养基中 (张等，2012)。
2. 取对数生长期 (增殖最快) 的微藻接种于柱光生物反应器中，1% CO₂，23 °C，300 μmol photons/m²·s持续光照24 h (da Silva，Santos等，2009b)。
3. 取2.5 ml微藻液，约含2 × 10⁶微藻细胞，微波炉预处理40 s，加入1% 的二甲基亚砜 (DMSO)，75 μl 50 μg/ml NR (终浓度为1.5 μg/ml)，40 °C避光染色5 min (da Silva，Reis等，2009a；Santos等，2010)。
4. 300 x g室温离心5 min, 弃上清。
5. 于微藻细胞沉淀中加入4 ml PBS，用移液枪吹打混匀，300 x g室温离心5 min，弃上清。
6. 用2 ml PBS将微藻细胞沉淀重悬，洗涤，300 x g室温离心5 min，小心去除上清，收集细胞沉淀。
7. 重复步骤6，将多余的荧光染料去除，预留200 μl液体，经70 μm滤膜过滤后流式细胞仪检测。
8. 在流式细胞仪上，先用未染色的微藻细胞悬液设置检测参数 (NR的激发波长543 nm，发射波长598 nm，荧光信号位于FL3通道)，调节阴性区域。上机检测至少获取1 × 10⁵ 的阳性细胞做后续数据分析。
   

结果与分析

Montero等通过NR对微藻T.suecica中油脂染色，实现分选油脂含量高的微藻群。如图1所示，野生型微藻T. suecica其油脂含量较低，通过NR荧光强度显示，利用NR荧光强度进行分选，经第一次分选后，油脂含量高的T. suecica的比例增多，分选后的微藻继续培养至第28天再经第二次分选，得到的大部分微藻中都含有大量油脂。散点图和直方图都显示经分选后微藻T.suecica中油脂的含量 (Montero等，2011)。


图1. 通过尼罗红NR对微藻T.suecica 中油脂染色，筛选富含高油脂的微藻群体. 取2.5 ml微藻液，经微波处理，NR染色，流式分选高油脂含量的微藻群。横坐标代表NR荧光强度，纵坐标代表微藻自发叶绿素荧光强度；上图为散点图，下图为直方图显示NR荧光强度 (Montero等，2011)。

失败经验

1. DMSO浓度大于5% 易导致荧光猝灭，1% 的比例能促进染料的染色效果。
2. 染色温度不宜过高，过高导致荧光猝灭。
   

溶液配方

1. 尼罗红试剂
   取适量尼罗红粉末溶于甲醇溶液中，配成50 μg/ml的储存液
2. BG-11培养基 (张等，2012）
   取硝酸钠 (0.5 g)、磷酸氢二钾 (0.04 g)、七水硫酸镁 (0.075 g)、二水氯化钙 (0.036 g)、柠檬酸 (0.006 g)、柠檬酸铁铵 (0.006g)、EDTA二钠 (0.001 g)、碳酸钠(0.02 g) 溶解于1 L去离子水，加入1 ml 1,000×微量元素溶液
   调节pH至7.5，121 °C灭菌15 min，灭菌后pH约为7.1，室温下储存 
3. 1,000×微量元素
   取硼酸 (2.86 g)、四水氯化锰 (1.81 g)、七水硫酸锌 (0.222 g)、二水钼酸钠 (0.39 g)、五水硫酸铜 (0.079 g)、六水硝酸钴 (0.0494 g) 按照顺序逐一溶于1 L去离子水中，用1 mol/L盐酸调节pH至7.2
   121 °C灭菌15 min，冷却后加入几滴氯仿，于室温下储存
   

致谢

本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金项目 (资助号：81703555，81773063，U1505225和81273548)、国家重点基础研究发展计划 (973计划) 项目 (资助号：2015CB931804)、中国大洋专项课题 (资助号：DY135-2-13)、福建省科技厅平台项目 (资助号：2018N2001)、教育厅平台项目和中国博士后科学基金 (资助号：2017M620268)的经费支持。

参考文献

1. 张敬键,吕雪娟,李爱芬,万凌琳,吴洪,尹顺吉,张成武. (2012). 微藻细胞油脂含量的快速检测方法. 中国生物工程杂志，32(1): 64-72.
2. da Silva, T. L., Reis, A., Medeiros, R., Oliveira, A. C. and Gouveia, L. (2009a). Oil production towards biofuel from autotrophic microalgae semicontinuous cultivations monitorized by flow cytometry. Appl Biochem Biotechnol 159(2): 568-578.
3. da Silva, T. L., Santos, C. A. and Reis, A. (2009b). Multi-parameter flow cytometry as a tool to monitor heterotrophic microalgal batch fermentations for oil production towards biodiesel. Biotechnol Bioproc 14:330.
4. Montero, M. F., Aristizábal, M. and Reina, G. G.(2011). Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting. J Appl Phycol 23(6): 1053-1057.
   
5. Santos, C. A., Ferreira, M. E., da Silva, T. L., Gouveia, L., Novais, J. M. and Reis, A. (2011). A symbiotic gas exchange between bioreactors enhances microalgal biomass and lipid productivities: taking advantage of complementary nutritional modes. J Ind Microbiol Biotechnol 38(8): 909-917.