肿瘤微环境内DC细胞亚型和成熟流式检测方法
The Detection of Dendritic Cell Subsets and Maturation in the Tumor Microenvironment by Flow Cytometry   

材料与试剂

材料：

1. 眼科剪及眼科镊
2. 1 ml移液枪及枪头
3. 6孔细胞培养平底板 (NEST^®, catalog number: 032819AA01)
4. 96孔细胞培养U底板 (NEST^®, catalog number: 112518AA03)
5. 15 ml离心管 (Thermo Fisher Scientific, Nunc^TM, catalog number: 339650)
6. 50 ml离心管 (Thermo Fisher Scientific, Nunc^TM, catalog number: 339652)
7. 无菌注射器 (上海康德莱企业发展有限公司，KDL^®)
8. 70 μm孔径滤网 (Corning, Falcon^®, catalog number: 352350)
9. 5 ml无菌圆底管 (带滤网) (Corning, Falcon^®, catalog number: 352235)

试剂：

1. 胎牛血清 (Gemini, Foundation^TM, catalog number: 900-108)
2. Anti-FcR (CD16/CD32) 抗体 (BioXCel, catalog number: BE0307)
3. 胶原蛋白酶I (Worthington Biochemical^®, catalog number: LS004186，-20°C储存)
4. 脱氧核糖核酸酶I，来源于牛胰腺 (Sigma-Aldrich^®, catalog number: DN25，-20°C储存) 
5. DMEM基础高糖培养液 (Hyclone^TM, catalog number: SH30243.01)
6. PBS (Hyclone^TM, catalog number: SH302560.31)
7. 乙醇
8. 5% DMEM培养液 (见溶液配方)
9. FACS buffer (见溶液配方)
10. 肿瘤组织消化液 (见溶液配方)

1. Anti-FcR (CD16/CD32) (BioXCell, BioXCell, catalog number: BE0307)
2. Fixable Viability Stain 780 (BD Bioscience, BD, catalog number: 565388)
3. Anti-mouse-CD45.2-BV785 (Biolegend,  catalog number: 109839)
4. Anti-mouse-Ly6C-BV605 (Biolegend, catalog number: 128035)
5. Anti-mouse-Ly6G-BV711 (Biolegend,  catalog number: 127643)
6. Anti-mouse-CD11b-PE/Cy7 (Biolegend, catalog number: 101216)
7. Anti-mouse-CD11c-APC (Biolegend,  catalog number: 117310)
8. Anti-mouse-CD103-APC/Cy7 (Biolegend, catalog number: 121432)
9. Anti-mouse-F4/80-BV421 (Biolegend, catalog number: 123137)
10. Anti-mouse-CD86-FITC (Biolegend, catalog number: 105005)
11. Anti-mouse-MHC class II (I-A/I/E)-PerCP/Cy5.5 (Biolegend,  catalog number: 107625)

仪器设备

1. 37 °C二氧化碳培养箱 (Thermo Fisher Scientific)
2. 电热恒温水槽 (上海一恒科学仪器有限公司，model：DK-8AXX)
3. 低温离心机 (Eppendorf^®, model: 5810R)
4. 微型台式真空泵GL-802B型 (Kylin-bell^®, model: GL-802B型)
5. Flow Cytometer (BD, model: LSRfortessa, or equivalent)
6. 恒温细胞培养箱
7. 超净工作台
   

实验步骤

1. 前期准备工作
   
   1.1

   分组标记：根据实验分组需求取若干六孔板，标记荷瘤小鼠信息。六孔板中每孔加入3 ml DMEM高糖培养基，将六孔板置于冰上待用。
   1.2

   配制肿瘤组织消化液：将预先配制的100× 消化液母液 (含100 mg/ml胶原酶I和20 mg/ml DNA酶I) 用含5% FBS的DMEM高糖培养基稀释100倍，即最终工作浓度为1 mg/ml胶原酶I和200 μg/ml DNA酶I。将1× 消化液置于37 °C水浴锅预热待用。
   1.3

   器械准备：根据实验分组需求准备适量的剪刀镊子，用双蒸水洗净后75%乙醇消毒，烘干备用。
2. 肿瘤组织的分离
采用颈椎脱臼法将荷瘤小鼠处死，喷洒75%乙醇消毒。左手持弯镊，右手持剪刀在肿瘤右侧1 cm处沿肿瘤边缘剪开一长约2 cm口子。左手捏住剪开处的皮肤向外翻折，可清晰见到肿瘤附着于皮下。用剪刀沿肿瘤边缘轻轻剪开，将肿瘤剥离，注意肿瘤若有溃烂，则避开溃烂之处。将剥离下来的肿瘤组织放入预先准备好的六孔板内。
3. 肿瘤组织的剪碎
待全部肿瘤剥离完毕，用移液枪吸出预留DMEM高糖培养基，余大约0.1 ml，以免在剪碎过程中肿瘤组织干燥。手持剪刀小幅度高频率剪碎肿瘤组织，将肿瘤组织剪成泥浆状，肉眼无法看见清晰组织块。注意以上步骤均在冰上操作。
4. 肿瘤组织的消化
将肿瘤组织剪成泥浆状后，每孔加入2 ml 1× 消化液，用1 ml枪头将肿瘤组织碎末打散，置于37 °C恒温细胞培养箱消化30 min，每隔10 min将六孔板取出晃动混匀一次。注意严格按照时间消化，以免影响免疫细胞活性。可根据肿瘤大小调整1× 消化液的用量。
5. 制备肿瘤细胞悬液
消化完毕后，将六孔板取出放于冰板上，每孔加入4 ml DMEM高糖培养基 (含5% FBS) 终止消化。用巴氏吸管吸取肿瘤组织悬液至70 μm细胞滤网过滤，同时用1 ml注射器后部研磨遗留在滤网上的组织块 (注意研磨时切勿用力，易将脂肪等带入细胞悬液中)，用DMEM高糖基础培养基冲洗滤网上的组织块，所得肿瘤悬液4 °C，850 x g，离心5 min。
6. 染色前封闭
由于髓系细胞表面表达较多Fc受体，容易对流式抗体有非特异性结合，故采用预先阻断Fc受体封闭。离心后弃上清，根据沉淀多少加入适量FACS缓冲液混匀，取10 μl细胞悬液计数，将悬液细胞密度调至2 × 10₇个/ml。取100 μl细胞悬液于U底96孔内，按100:3比例加入抗Fc受体抗体 (即每100 μl细胞悬液加入3 μl抗Fc受体抗体)，4 °C孵育30 min。
7. 配制流式染色抗体
按照表1配制流式抗体混合液 (用FACS缓冲液配制)，每孔加入70 μl流式抗体混合液，根据需要计算每个流式抗体所需体积。

注：由于F4/80、MHCII、CD11c、CD86染色均显示漂移，没有明显分群，需要额外增加空白对照 (不加相应的流式抗体) 和荧光扣除对照 (加入与相应流式抗体一样的只带荧光的流式抗体)。以anti-mouse-CD11c-APC为例，空白对照即不加CD11c-APC这支流式抗体，而荧光扣除对照则是添加anti-rat-IgG-APC。

表1. 肿瘤微环境内MDSCs流式染色配色

 注：流式抗体使用配色可自行调整，注意不要使用补偿过大的荧光通道。另外，MC38皮下瘤模型中DC基本为DC2，未见CD103+DC1。

8. 流式染色
封闭结束后，4 °C 850 x g离心5 min。弃上清，每孔加入70 μl流式抗体混合液，轻柔吹打混匀，注意不要有气泡。将96孔板置于4 °C避光，染色30 min。
9. 洗涤、上机
染色结束后每孔加入200 μl FACS缓冲液，4 °C 850 x g离心5 min。弃上清后再次加入200 μl FACS缓冲液洗涤一次，4 °C 850 x g离心5 min。弃上清，加入300 μl FACS缓冲液重悬细胞，将细胞悬液转移至带滤网的流式管中 (同时过滤细胞悬液)。制备好的流式染色样品用BD Fortessa进行分析，数据处理软件采用FlowJo Version 10.0。

结果与分析

设门方式 (图1)：
DC2：Single cell, live, CD45+Ly6C-Ly6G-CD11c+MHCII+F4/80-CD11b+
成熟标志：CD80，CD86

  
图1. 肿瘤内DC的设门方式

溶液配方

注：以下溶液均在超净台内配制。

1. 5% DMEM培养液
   DMEM基础高糖培养液 + 5%胎牛血清
   4 °C冷藏，1个月内使用
2. FACS buffer
   PBS + 2%胎牛血清
   4 °C冷藏，1周内使用
3. 肿瘤组织消化液
   5%DMEM培养液 + 胶原蛋白酶I (工作浓度：1 mg/ml) + 脱氧核糖核酸酶I (工作浓度：200 μg/ml)
   

参考文献

1. Bottcher, J. P., Bonavita, E., Chakravarty, P., Blees, H., Cabeza-Cabrerizo, M., Sammicheli, S., Rogers, N. C., Sahai, E., Zelenay, S. and Reis e Sousa, C. (2018). NK Cells Stimulate Recruitment of cDC1 into the Tumor Microenvironment Promoting Cancer Immune Control. Cell 172(5): 1022-1037 e1014.
2. Guilliams, M., Ginhoux, F., Jakubzick, C., Naik, S. H., Onai, N., Schraml, B. U., Segura, E., Tussiwand, R. and Yona, S. (2014). Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nat Rev Immunol 14(8): 571-578.
3. Salmon, H., Idoyaga, J., Rahman, A., Leboeuf, M., Remark, R., Jordan, S., Casanova-Acebes, M., Khudoynazarova, M., Agudo, J., Tung, N., Chakarov, S., Rivera, C., Hogstad, B., Bosenberg, M., Hashimoto, D., Gnjatic, S., Bhardwaj, N., Palucka, A. K., Brown, B. D., Brody, J., Ginhoux, F. and Merad, M. (2016). Expansion and activation of CD103⁺ dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition. Immunity 44(4): 924-938.