摘要:通过超薄切片,获得细胞水平的结构;同时通过免疫染色,观察目的蛋白在细胞内的定位及变化情况。
关键词: 胶体金, 免疫定位, 细胞
材料与试剂
注: 以下试剂除特别说明外,均购自Sigma-Aldrich公司。
- 苹果
- 多聚甲醛
- 戊二醛
- PBS (磷酸缓冲液,pH 7.2)
- 乙醇
- Lowicryl K4M
- Formvar膜
- 金标羊抗兔抗体 (Amersham Pharmacia Biotech)
- 柠檬酸铅
- 兔血清
- Na2HPO4
- KH2PO4
- KCl
- NaCl
- 明胶
- BSA
- Tween 20
- 2% (w/v)醋酸双氧铀 (蒸馏水配制)
- 前固定液 (见溶液配方)
- 含50 mM甘氨酸缓冲液 (见溶液配方)
- PBGT缓冲液 (见溶液配方)
仪器设备
- 镍网
- 抽气泵
- 紫外灯
- LKB-8800型切片机
- 透射电镜
实验步骤
- 样品包埋
1.1固定:将苹果果肉切分成2-3 mm3的小块,迅速投入已预冷的前固定液 (见溶液配方1)中,抽气直到组织块完全浸入固定液,4 °C下固定4 h。
1.2冲洗:用0.1 M PBS (磷酸缓冲液,pH 7.2;280 ml 1 mol/L磷酸二氢钠,720 ml 1 mol/L磷酸氢二钠) 4 °C洗三次,每次30 min。
1.3乙醇系列脱水
30%乙醇 (20min)→50%乙醇 (20min)→70%乙醇 (过夜)→80%乙醇 (20min)→90%乙醇 (60min)→100%乙醇 (60min)→100%乙醇 (60min)
1.4乙醇-Lowicryl K4M置换
无水乙醇:K4M2:11 h
无水乙醇:K4M1:11 h
无水乙醇:K4M1:21 h
纯K4M1 h (此为逐步过渡到K4M中,1 h后更换K4M,然后浸透过夜)
1.5浸透:换入新的纯K4M浸透过夜 (以上步骤均在4 °C下进行)。
1.6包埋:紫外灯下 (-20 °C) 聚合48 h以上,室温继续聚合3天以上,直到手感可触硬化。
1.7切片:用LKB-8800型切片机制备超薄切片,切片捞在100目以0.3% Formvar膜覆盖的镍网上。 - 免疫染色
2.1.切好的超薄切片先用含50 mM甘氨酸缓冲液 (见溶液配方2) 室温下处理30 min以封闭自由醛基,然后在PBGT溶液 (见溶液配方3) 中继续封闭30 min以封闭非特异性位点。
2.2.切片不经清洗,直接在用PBGT缓冲液稀释100倍的一抗中于4 °C下温育过夜 (或室温下1-2 h)。
2.3.经PBGT充分洗涤3次,每次5 min。
2.4.清洗完毕后,转入用PBGT稀释的金标羊抗兔抗体 (交联10 nm金颗粒,1:50比例稀释),室温下温育1-2 h。
2.5.经PBGT冲洗三遍,后经双蒸水充分洗涤三遍。每次5 min。
2.6.2% (w/v)醋酸双氧铀室温染色18 min,之后用双蒸水冲洗3次。
2.7.柠檬酸铅继续染色10 min,用双蒸水充分洗涤 (6 x 5 min)。
2.8.用透射电镜进行细胞超微结构及金颗粒定位观察。
注:为了检验免疫定位结果的特异性和可靠性,需分别设置2种不同的对照:
- 以免疫前兔血清代替蛋白抗体以验证一抗的特异性;
- 免去蛋白抗体以检测二抗的非特异性标记,其余步骤同上。
溶液配方
注:本实验方案中所需的溶液除特殊说明外,均用蒸馏水配制。
- 前固定液
4% (w/v)多聚甲醛
2.5% (v/v)戊二醛
0.1 M PBS, pH 7.2 配制 - 50 mM甘氨酸缓冲液, pH 7.4
Na2HPO4
| 8 mM
|
KH2PO4
| 1.5 mM
|
KCl
| 3 mM
|
NaCl
| 500 mM
|
- PBGT缓冲液
PBS缓冲液
0.1% (w/v)明胶
0.5% (w/v)BSA
0.1% (v/v)Tween 20
致谢
本篇实验方案改编自先前发表的文章 Zhang et al. (2004)。
参考文献
- Zhang, L. Y., Peng, Y. B., Pelleschi-Travier, S., Fan, Y., Lu, Y. F., Lu, Y. M., Gao, X. P., Shen, Y. Y., Delrot, S. and Zhang, D. P. (2004). Evidence for apoplasmic phloem unloading in developing apple fruit. Plant Physiol 135(1): 574-586.
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:张凌云. (2018). 苹果果肉细胞胶体金免疫电镜观察样品的制备.
Bio-101: e1010242. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010242.
How to cite: Zhang, L. Y. (2018). (2018). Sample Preparation of Apple Fruit for Observation of Protein Subcellular Localization by Immunogold Labeling and Electron Microscopy.
Bio-101: e1010242. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010242.