青杆花粉细胞中蛋白免疫染色定位实验—以RAC1蛋白为例
Subcellular Localization of RAC1 in Pollen Tube of P. willsonii by Immunostaining and Confocal Laser Scanning Microscopy   

材料与试剂

注: 以下试剂除特别说明外，均购自Sigma-Aldrich公司。

1. 载玻片
2. 盖玻片
3. 移液枪头
4. 多聚赖氨酸
5. 多聚甲醛
6. Triton X-100
7. Cellulase R-10 
8. Macerozyme R-10 
9. 甘露醇
10. CaCl₂
11. 蛋白酶抑制剂 (Aprotinin, Pepstatin A, Chymostatin, Leupeptin; Calbiochem)
12. 脱脂奶粉或BSA 
13. 10%胎牛血清 (FBS)
14. anti- RAC1 antibody (Nicotiana tabacum) was a generous gift from Prof. Alice Cheung (University of Massachusetts, Amherst, MA)
15. 免疫前动物血清
16. NaCl
17. KCl
18. Na₂HPO₄
19. KH₂PO₄
20. 碘化丙锭 (PI)
21. PBS缓冲液 (见溶液配方)
22. 固定液 (见溶液配方)
23. 1.5% Cellulase R-10 (见溶液配方)
24. 1.2% Macerozyme R-10 (见溶液配方)

仪器设备

1. 支架
2. 离心机
3. 落射式荧光显微镜
4. LCSM (ZEISS, model: LSM 510 META)
   

实验步骤

1. 准备工作：用Poly-Lysine包被载玻片
   1.1用蒸馏水配制1 mg/ml 多聚赖氨酸溶液 (400 kD)，应每周新配制一次。
   1.2在干净的载玻片、滴加1-2滴多聚赖氨酸溶液作用10 min。
   1.3蒸馏水冲洗玻片数次，放于支架上，空气干燥，然后室温保存。
2. 染色过程
   2.1黏附
   
   1)

   取培养不同时期的花粉管悬浮液。
   2)

   400 x g离心5 min，洗涤细胞。
   3)

   重悬细胞于PBS中，重复1次。
   4)

   重悬细胞于PBS中，调整细胞浓度至1 x 10⁵/ml。
   5)

   滴加到多聚赖氨酸包被的载玻片上，室温下静置10 min。
   2.2固定
   
   1)

   加入4%多聚甲醛 (现用现配)，室温孵育2 h。
   2)

   吸去多聚甲醛，PBS充分洗涤2 x 5 min。
   2.3透化
   
   1)

   加入含酶混合液反应10 min，酶混合液包括用15 mM MES 配制的1.5% 的纤维素酶 (cellulase R-10) 和1.2% 离析酶 (macerozyme R-10)，pH 5.5, 400 mM 甘露醇, 5 mM CaCl₂, and 1 mg ml 1 蛋白酶抑制剂 (Aprotinin, Pepstatin A, Chymostatin, Leupeptin; Calbiochem).
   2)

   PBS洗涤4 x 5 min。
   2.4封闭
   用PBS配制的3% (W/V) 脱脂奶粉或BSA [或10%胎牛血清 (FBS)] 室温下封闭1 h。
   2.5一抗孵育
   
   1)

   用anti-RAC1 antibody (1:40 dilution) 在30 °C下孵育1-2 h (一抗用含1% (W/V) 脱脂奶粉的PBS配制) 。
   2)

   用PBST清洗3 x 10 min (PBST：PBS + 0.05 或0.2% (V/V) Triton X-100) 吸净液体，但不可干燥。
   注：加入足够量的一抗使其覆盖细胞，但不要溢出载玻片边缘，通常加入10 μl-25 μl。通常要湿孵。
   2.6二抗孵育
   
   1)

   加入FITC标记的二抗，30 °C下孵育1 h (二抗用PBS + 1%脱脂奶粉以1：100稀释) 。
   2)

   用PBST清洗3 x 10 min (PBST：PBS + 0.05或0.2% (V/V) Triton X-100) 同上吸干。
   2.7封片
   滴加50 μl封固液于载玻片上，加盖玻片，注意赶出气泡。空气干燥30 min。
   2.8用DAPI复染
   
   1)

   如需要用DAPI对核进行染色，需向二抗中加0.01 mg 4’,6-diamindino-2-phenylindole (DAPI) 溶液数微升孵育10 min，即可使核酸特异性染色。
   2)

   观察 Confocal显微镜观察，激发波长参考表1。
   注：1 μg/ml碘化丙锭 (PI) 适用于激光共聚焦扫描显微镜 (CLSM)。
   
   
   表 1. 荧光染料激发光及发射光波长参考
   
   

注意事项

1. PBS缓冲液
   10 mM磷酸缓冲液，pH 7.4
   138 mM NaCl
   2.7 mM KCl
   将8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄、0.24 g KH₂PO₄，溶解于800 ml蒸馏水中，调整pH至7.4，补充液体至1 L，可配成10x储存液 (参考抗体技术指南)
2. 固定液
   4%多聚甲醛，用PBS配制 (参考抗体技术指南)
3. 封片液
   0.35 g Gelvatol加至3 ml蒸馏水和1.5 ml甘油中，沸水加热溶解，加DABCO至2.5%，4 °C可保存数月。
4. 15 mM MES 配制
   计算MES用量至终浓度 150 mM，用Tris碱溶液调节pH至5.5；加水定量便可
5. 1.5% Cellulase R-10
   用15 mM MES 配制
6. 1.2% Macerozyme R-10
   用15 mM MES 配制
   

参考文献

1. 抗体技术指南
2. Zhang, L. Y., Hao, H. Q. and Lin, J. X. (2007). The localization of Rac GTPase in Picea willsonii pollen tubes implies roles in tube growth and the movement of the tube nucleus and sperm cells. PLANT SCI 172(6):1210-1217.